רגישותם של בני אדם לכמויות מזעריות של אנדוטוקסינים מחייבת איתור מוקדם שלהם טרם השימוש במכשירים רפואיים, מי דיאליזה, תרופות ועוד. במאמר זה נתאר את הבדיקות השונות לזיהוי אנדוטוקסינים (Bacterial Endotoxin Test).
מאת: עילם ניר ראש צוות בדיקות BET.
אנדוטוקסינים (Endotoxin) הם רעלנים הנמצאים בממברנה של חיידקי גראם שליליים (Gram–negative bacteria). הם אינם מהווים סכנה כאשר נמצאים מחוץ לגוף האדם, אך הופכים לרעלנים חזקים מאוד כאשר מוחדרים לזרם הדם. בעבר לא היו שיטות לבדיקת אנדוטוקסינים, והדבר הוביל לכך שאנשים אשר קיבלו זריקות פיתחו במרבית המקרים חום אשר היה ידוע כ-Injection Fever. ואכן, בכמויות מזעריות האנדוטוקסינים גורמים לעליית חום אולם בכמויות גדולות יותר עשויים לגרום לכשל ריאתי, כשל כלייתי ותגובה דלקתית מערכתית העשויה להביא לשוק ספטי ומוות. אנדוטוקסינים נמצאים כמעט בכל סביבה בחיינו ולכן מהווים מטרד גדול עבור יצרני תרופות פאראנטרליות (תרופות בהזרקה), מכשירים רפואיים וספקי חומרי הגלם. האתגר קשה במיוחד מאחר וקשה מאוד לנקותם ולהסירם מהרגע שחדרו אל המוצר המוגמר.
עקב רגישותם של בני אדם אפילו לכמויות מזעריות של רעלנים אלו, קיימת חשיבות גדולה מאוד לביצוע בדיקות לזיהוי נוכחותם של אנדוטוקסינים. במעבדתנו מתבצעות בדיקות Bacterial Endotoxin Test (BET) עבור מאות דוגמאות של מכונות דיאליזה מבתי החולים של קופ"ח כללית, בדיקות עבור חברות Medical Device שלהן עשרות מכשירים רפואיים מסוגים שונים דוגמת שתלי שיניים, צנטרים ללב ולמוח, שתלים אורתופדיים וכן שתלים ומוצרים בהם נעשה שימוש ברפואה אסתטית, ושחרור מהיר של אצוות לטיפול בחולים במעבדה. בין לקוחותינו נמצאות חברות מהגדולות ביותר בתחום הביוטק הישראלי, עשרות חברות פארמה לצד מרבית חברות ה-Cell Therapy בארץ.
מהלך בדיקת אנדוטוקסינים
בעבר בדיקות אנדוטוקסינים התבצעו אך ורק על ידי מדידת עליית חום גופן של ארנבות להן הזריקו את התמיסות הנבדקות. אולם במשך שנים רבות היה ידוע כי דמם של סרטני הפרסה (Horseshoe crab) עובר קרישה בעת פציעה. הדם של סרטנים אלה מכיל תאי אמבוציט, שהנם אנאלוגיים לתאי הדם הלבנים בבני אדם. בעת מגע עם חיידקי גראם שליליים תאי האמבוציט של הסרטן יוצרים שכבת ג'ל סביב החיידק הפולש ובכך מגינים על גופו של הסרטן מפני פגיעה מזיהום.
בעת מגע עם חיידקי גראם שליליים תאי האמבוציט של סרטני הפרסה יוצרים שכבת ג'ל סביב החיידק הפולש
רק בשנות ה-20 של המאה ה-20 התגלה המסלול האנזימטי הגורם לכך: הימצאות אנדוטוקסינים גורמים להפעלת חלבון C, שבתורו מפעיל 'מפל' תהליכים שגורמים להפעלתו של אנזים קרישה הגורם ליצירת הג'ל. בעקבות כך פותחה שיטת ה-LAL (Limulus Amebocyte Lysate) העושה שימוש בתמצית תאי האמבוציט מסרטני הפרסה לזיהוי נוכחות אנדוטוקסינים. בשנות ה 70 חברות התרופות החלו עושות שימוש הולך וגובר בבדיקות ה-BET ומצאו אותן מהימנות ורגישות יותר מבדיקת הארנבות, כמו גם זולות יותר, אם כי חייבו לכידה מאסיבית של סרטנים. עם כניסת הראגנטים לשימוש, בדיקת ה-LAL הפכה לאחד הכלים החשובים ביותר בתעשיית התרופות והמכשירים הרפואיים.
מכשיר ה- Pyros משמש לבדיקת BET (נקראת לעתים בדיקת LAL).
בדיקת ה-LAL מתבצעת בתווך מיימי על ידי תגובה בין תמיסת ה-LAL, המכילה את תמצית תאי האמבוציט, לתמיסה הנבדקת. ישנן 3 שיטות המוכרות על ידי הפרמקופיאה עבור בדיקות אנדוטוקסינים חיידקיים (BET-Bacterial Endotoxin Test) אשר ניתן לעשות בהן שימוש עבור בדיקת תרופות הניתנות בהזרקה או מכשירים רפואיים טרם שיווקם לצרכן:
שיטת Gel Clot: שיטה חצי-כמותית הנחשבת כ-"Gold Standard" בפרמקופיאה. היא השיטה הוותיקה והפשוטה ביותר מבין השלוש. יתרונה הגדול הוא בפשטותה, ניתן ללמוד אותה בקלות והיא לא דורשת מכשור מורכב ויקר. שיטה זו כרוכה בערבוב של התמיסה הנבדקת יחד עם ה-LAL, אינקובציה ובדיקת המבחנות להיווצרות ג'ל. שיטה זו ניתנת לשימוש עבור סוגי הדוגמאות: מים, תרופות, אבקות ומכשירים רפואיים. לשיטה זו מספר חסרונות ובהן הזמן הדרוש להכנת הדוגמאות, השיטה הינה פחות רגישה מהשיטות החדשות וכן היא לא מאפשרת אוטומציה ומעקב מידע על ידי מערכות מחשוב.
השיטה הקינטית טורבידימטרית: שיטה פוטומטרית-כמותית העושה שימוש בהיווצרות הקריש כפרמטר מדיד. במהלך הבדיקה הדוגמה מעורבבת עם ה-LAL ומוכנסת לתוך ספקטרופוטומטר העוקב אחר העלייה בבליעה במבחנה לאורך זמן עם היווצרות הקריש בהשוואה לעקומת כיול המורכבת מאנדוטוקסינים ברמות שונות. ככל שיש יותר אנדוטוקסינים בדוגמה כך הקריש נוצר מהר יותר וכך הבליעה עולה מהר יותר. בשיטה זו ניתן לבדוק תרופות, דוגמאות מים וכן מכשירים רפואיים, אך היא איננה מתאימה לבדיקת חומרים עכורים. השיטה רגישה יותר משיטת ה-Gel Clot ומדויקת יותר, כמו כן מתבצע תיעוד ממוחשב על ידי תוכנות ייעודיות לבדיקה.
עילם ניר ראש צוות בדיקות BET במעבדה.
השיטה הקינטית כרומוגנית: שיטה פוטומטרית-כמותית נוספת העושה שימוש בתגובה האנזימטית ליצירת צבע במבחנה כתגובה להימצאות אנדוטוקסינים. במקום שייווצר קריש במבחנה, אותו אנזים מבצע חיתוך של סובסטראט אשר חיתוכו גורם להיווצרות צבע צהוב אשר נמדד על ידי ספקטרופוטומטר ומושווה לעקומת כיול, ככל שריכוז האנדוטוקסינים גבוה יותר כך נוצר הצבע מהר יותר ואיתו בליעת האור. בשיטה זו ניתן לא ניתן לבדוק חומרים בעלי צבע והיא מתאימה אך ורק לדוגמאות שקופות לחלוטין כמו דוגמאות מים וכן מכשירים רפואיים.
לאחרונה פותחה שיטה נוספת אשר איננה תלויה בתמציות דמם של הסרטנים. שיטה זו מתבססת על יצירתו של חלבון C רקומביננטי המיוצר בקווי תאים במעבדה. מדובר באותו החלבון הטבעי הקיים בסרטנים ולא חלבון סינטטי. על ידי כך מתבטלת התלות בלכידתם של הסרטנים, אשר אינם נמצאים בסכנת הכחדה אך אוכלוסייתם הצטמצמה מאוד בשנים האחרונות. שיטה זו היא ככל הנראה העתיד של בדיקות האנדוטוקסינים (Endotoxin Test) אך כיום היא עדיין איננה מוכרת כשיטה קומפנדיאלית על ידי הפרמקופיאה.
נשמח לקבוע אתכם פגישת ייעוץ במהלכה נלמד את הצרכים שלכם כחברה, ואתם תוכלו להתרשם מעבודתנו המוקפדת והאיכותית. הייעוץ כולל בחירה והתאמה של הבדיקה עבור המוצרים שלכם, ניתוח דרישות הרגולציה הנוכחית והעתידית והמלצה כיצד להיערך לבדיקת תיקוף מוצלחת של המוצרים. מוזמנים להתקשר: 0544393425 או לשלוח מייל: Lee@HyLabs.co.il