ד"ר נתלי אורלובצקי, מנהלת מעבדת הריצוף בשיטת Sequencing עונה לשאלות הנפוצות ביותר מצדכם – הלקוחות. רוצים לשאול שאלה שלא מופיעה? יש לכם עוד שאלות? מוזמנים לפנות אלינו.
צוות מעבדת ה -Sequencing של hylabs מטפל בעשרות דגימות המגיעות מדי חודש ומספק מענה לשאלות שונות שאתם, לקוחותינו, מציגים לנו. על מנת להקל עליכם בתהליך ואולי גם לענות על שאלות נוספות שהייתם רוצים לשאול, ביקשנו מד"ר נטלי אורלובצקי, מנהלת מחלקת מעבדות מולקולאריות, לרכז את השאלות הנפוצות ביותר שאנחנו מקבלים ולהשיב עליהן מול המצלמה.
באותה הזדמנות ביקשנו מהם לתת כלים נוספים לחוקרים ולאנשי המעבדות ולהזמין אתכם להיעזר ביכולות המתקדמות של המעבדה המעמידה לרשותכם צוות מהשורה הראשונה ומציעה ליווי לאורך התהליך.
מוזמנים לצפות בסרטון הוידיאו בו ד"ר נטלי אורלובצקי עונה על השאלות – מול המצלמה.
מעדיפים לקרוא? ריכזנו עבורכם את השאלות והתשובות שהוצגו בסרטון.
כיצד שולחים דוגמאות?
"ישנן דרכים רבות לשלוח את הדוגמאות. ניתן לשלוח תוצרי PCR לפני ניקוי/אחרי ניקוי. ניתן לשלוח כפרמיקס (דנ"א ופרימר ביחד ), או כל מבחנה בנפרד. חשוב לשלוח כמויות ע"פ הרשום בטבלאות באתר ושעל המבחנות יהיה רשום שם הדוגמא כפי שרשום בהזמנה באתר, בכתב ברור וקריא.
בנוסף, הכנו מגנט המסכם בטבלאות את ההנחיות לשליחת הדוגמאות. מי שמעוניין לקבל את המגנט, מוזמן להוסיף את הבקשה בהזמנה הקרובה ואנחנו נעביר לכם אותו עם השליח."
מה הם הריכוזים שצריך לשלוח ?
"כל הריכוזים והכמויות רשומים בטבלאות באתר. חשוב לשלוח בעודף אחרת לא נוכל לעשות חזרות במידת הצורך".
מתי יהיו תשובות ?
"לרוב התשובה מתקבלת יום למחרת מקבלת הדוגמא, בתנאי שהדוגמא הגיעה עד ארבע אחה"צ. במידה והדוגמא דורשת ניקוי מג'ל או– PCR – תוצאות ישוחררו תוך יום עבודה נוסף.
למה יש לי רקע ברצף?
"רקע נובע מתוצר לא נקי, או קישור לא ספיציפי של פריימרים ל DNA".
למה לא התקבל רצף?
"יכולות להיות סיבות רבות לאי הצלחת הריצוף: איכות דנ"א ירודה, איכות הפרימר שאינו מתאים בצורה אופטימלית, רצף קשה, גן בעייתי (רצף GC reach), חוסר התאמה בין הפריימר לדנ"א, הפריימר בריכוז לא תקין , גן בעייתי עם מבנים שניוניים. כמובן שיכולות להיות גם תקלות טכניות. אנחנו יכולים לחזור על הרצף לפעמים, וחשוב שתדעו, אנחנו תמיד פתוחים ומוכנים לשאלות שלכם ונשמח לייעץ ".
האם אפשר לשלוח לריצוף דנ"א גנומי?
"בקצרה, רצף גנומי לא מתאים. בשיטת סנגר ניתן לרצף רק תוצר PCR מנוקה או פלסמידים".
מדוע חסרים בסיסים ?
"אנחנו לא מדלגים על בסיסים לא מוחקים/מוסיפים בסיסים מהרצף. חשוב במקרה כזה ללמוד מה קרה פה. לפתוח את הרצף ולהסתכל עליו היטב. ליתר בטחון מומלץ לרצף מהצד השני ולהשוות את הרצפים".
האם ניתן לקבל בשיטת Sequencing תשובות באותו יום?
"לצערנו לא ניתן לקבל תשובות באותו יום. תהליך הריצוף לוקח לפחות 7 שעות".
מה אורך הרצף שמתקבל ?
"לגבי פלסמידים, אם הפלסמיד באיכות טובה אנחנו מגיעים עם המכשירים שלנו עד לאורך באיזור 800-900 בסיסים. עם תוצרי ה – PCR זה קצת שונה. במידה ומדובר בתוצר PCR ארוך, אז כמו פלסמיד, תלוי באיכות הדנ"א. זה יכול להגיע גם ל 800-900 בסיסים אבל זה תלוי ב Template שלכם עצמו. חשוב לציין שהרצף בעצם מתחיל כ-30 בסיסים אחרי הפריימר".
כיצד פותחים את הקובץ עם התשובות ?
"כאשר אנחנו שולחים את התשובות, אתם מקבלים 2 קבצים. קובץ אחד זה ה seq שנפתח בתוכנות כמו: word או notepad ומספק את הרצף באותיות. הקובץ השני זה קובץ AB1 שמכיל את הכרומוטוגרמה של הרצף, וחשוב מאוד לעיין בו כי כך ניתן ללמוד על איכות הרצף ותרגום הפיקים לאותיות. ניתן לפתוח אותו בתוכנות מיוחדות המיועדות לפתיחת כרומטוגרם. ישנם מספר תוכנות חינמיות כמו Chromas אוbioedit . ניתן למצוא את הלינקים אליהם באתר שלנו".
יש לי שני תוצרים ב PCR האם ניתן לרצף אותם ביחד?
"התשובה הקצרה היא לא. ברגע שיש שני בנדים או שני תוצרי PCR ואנחנו נרצף אותם ביחד באותה ריאקציה בתהליך הריצוף אנחנו נקבל תערובת. כשהריאקציה רצה מקבלים שני רצפים שיתלבשו אחד על השני והתוצאה לא תהיה קריאה. במקרה כזה יש להריץ את התוצרים האלו שוב בג'ל, להגיע לרזולוציה טובה שתהיה לנו הפרדה טובה של שני הבנדים, לנקות אותם מהג'ל כל אחד בנפרד (לחתוך כל בנד בנפרד) להפיק דנ"א מהג'ל ולשלוח אותם אלינו למעבדה לריצוף של כל בנד בנפרד".
למה יש לי הרבה N ברצף?
"הרצף בריאקציית Sanger מתבצע כך שכל נוקלאוטיד בקצה הרצף הינו נוקלאוטיד פלורסנטי המתורגם בתוכנה לאות ספציפית המסמנת אותו. כאשר מדובר בתערובת, ברצף כפול או להפך בריאקציה באיכות ירודה אין סיגנלים והאותיות לא מתורגמות לסיגנל ספציפי ומקבלים לכן סיגנל N. במקרה כזה חשוב מאוד לפתוח את הדיאגרמה ולהסתכל על הרצף ולהבין מה קרה כאן".
Next Generation Sequencing – רשימת הפתרונות שאנו מציעים