אינה וויינשטיין, מנהלת פרויקטים וולידציות, ואבישג שיר לוגסי, סגנית מנהלת מעבדת שירותי מיקרוביולוגיה סוקרות את עולם בדיקות המיקופלזמה (Mycoplasma) את הרגולציה הרלוונטית לתחום, את חשיבות בדיקות המיקופלזמה ואת שיטות הבדיקה המתקדמות הנהוגות ב hylabs.
לצפייה בוובינר לחצו על התמונה (צפייה ראשונית מחייבת רישום קצר)
Mycoplasma הינה קבוצת חיידקים שמאופיינים בכך שאין להם דופן תא, המין מונה יותר מ 120 זנים. Mycoplasma הינם היצורים הפרוקריוטים הקטנים ביותר שמכפילים את עצמם, גודל וצורת התא של Mycoplasma משתנה. מבחינת גודל, גודלם נע בין 0.1-0.8 מיקרון (בין חיידקים לוירוסים) וניתן, לראותם תחת מיקרוסקופ אור/אלקטרוני. Mycoplasma יכולים להיות פתוגנים לבני אדם, חיות וצמחים.
בבני אדם, Mycoplasma הם בדרך כלל טפילים, המתיישבים על פני שטח תאי האפיתל של דרכי הנשימה והרבייה. הם שכיחים ועלולים לגרום לזיהום חמור בתרביות תאים ו/או רקמות. בתרביות תאים Mycoplasma הם אחד הגורמים העיקריים לזיהומים וקשה לזהותם מאחר ונוכחותם של זני Mycoplasma לא תמיד גורמת לעכירות בתרבית או לשינוי נראה של התאים. אחד הקשיים הגדולים בהתמודדות עם זיהומי Mycoplasma, כיוון שאין לה דופן תא, הוא עמידותם לאנטיביוטיקות שדרך פעולתן היא הפרעה בסינטזת הדופן.
הרגולציות הרלוונטיות למיקופלזמה הן:
European Pharmacopeia, פרק 2.6.7
US Pharmacopeia, פרק 63
הרגולציות דנות בפירוט רב בצורך ובחשיבות בדיקות Mycoplasma , בעיקר למוצרים המיועדים לשימוש בני אדם. בדיקת Mycoplasma היא דרישה הכרחית כחלק מבקרת איכות כדי להבטיח שמוצרים ביוטכנולוגיים וחומרים נלווים המשמשים לייצור מוצרים אלה חפים Mycoplasma.
השיטה המפורטת בפרמקופיאות היא Mycoplasma בתרבית (Culture Mycoplasma) אך בשתיהן יש אזכור לאפשרות ביצוע הבדיקה בשיטה אלטרנטיביות ולידית, לדוגמה שיטות המבוססות PCR, שכן לעיתים זמן הבדיקה הינו ארוך ביחס לחיי המדף/תוקף המוצר או שמא ישנן סיבות אחרות בגללן לא ניתן לבצע בדיקה זו בשיטת התרבית.
בדיקת Mycoplasma Culture
לצורך ביצוע של Mycoplasma Testing בשיטת התרבית נדרשים לפחות 11 מ"ל דוגמה. הבדיקה מבוצעת תוך שימוש במצעי גידול נוזליים (Broth) ומוצקים (Agar) 10 מ"ל דוגמה מועברים לנפח של 100 מ"ל מצע נוזלי כמו גם זריעת בידוד של הדוגמה בתחילת הבדיקה על מנת לוודא כי הדוגמה אינה מזוהמת טרם הבדיקה.
המיכל המכיל את הדוגמה במצע הנוזלי מודגר למשך 20-21 ימים. במקביל לדוגמה נבדקות שתי בקרות, חיובית ושלילית, בביקורת החיובית ישנו ייצוג של שני זני Mycoplasma. במהלך ההדגרה בכל פרק זמן, המוגדר בפרמקופיאות, מתבצעת זריעת בידוד על גבי מצע מוצק. לאחר אינקובציה נוספת של צלחות האגר ישנה בחינה מיקרוסקופית של הצלחות להימצאות/אי הימצאות מושבות Mycoplasma. לצורך קבלת תוצאות מהימנות והדירות יש צורך בתיקוף שיטת הבדיקה (וולידציה) לכל מוצר ספציפי.
במסגרת וולידציה לבדיקת Mycoplasma Culture נבדקת הדוגמה במקביל לביקורת חיובית בנוכחות 4 זני Mycoplasma, ברמת אילוח של עד ,100 cfu כל אחד בנפרד וכמובן ביקורת שלילית.
Mycoplasma Testing באמצעות Nested PCR
אנחנו מבקשים מהלקוח לשלוח לנו 4 מבחנות שבכל אחת 1 מ"ל של הדוגמא אותה הוא רוצה לבדוק. אם מדובר על בדיקה של תאים בתרבית ההמלצה היא לגדל אותם קודם 3 ימים ללא אנטיביוטיקה ולשלוח להו בכל מבחנה 1 מל של מדיום בו גדלו התאים ועד 105 תאים. 2 מבחנות נכנסות לטסט ו 2 מבחנות נשמרות למקרה הצורך בחזרה.
בכל טסט נבדקת ביקורת שלילית, ביקורת פנימית שנכנסת לתוך אחת המבחנות של דוגמאת הלקוח וביקורת חיובית. תחילה, הדוגמאות מתחלקות ל 2: דוגמאות שנבדקות כמו שהן ודוגמאות שמקבלות אילוח בביקורת פנימית. לאחר מכן כל הדוגמאות במקביל עוברות הפקת DNA עם חומרים המיוצרים במעבדות חי.
תוצרי ה DNA נכנסים לריאקצית PCR ראשונה שמגבירה מקטע ספציפי ל- Mycoplasma (אם הוא קיים בדוגמא). תוצרי הריאקציה הראשונה נכנסים לריאקציית PCR שנייה שמגבירה מקטע פנימי יותר של Mycoplasma לכמות שניתן לזהות בקלות.
תוצרי ה PCRs מורצים בג'ל אלקרפורזיס ולפי הבנדים הנצפים אנחנו יכולים לראות אם היה או לא היה DNA של Mycoplasma בדוגמאות שנבדקו. מעצם הנוכחות של הביקורת הפנימית בג'ל אנחנו יכולים לראות שלא היה עיכוב בריאקציות ה PCR ובמקרה שהיה לבצע התאמה של שיטת ההפקה כדי לקבל תוצאות מהימנות.
רגישות: 1-10 cfu/ml.
קבלת תוצאות: תוך עד 3 ימי עבודה.
על פי עבודה ביואינפורמטית קיים זיהוי של מעל 100 זנים של Mycoplasma.
במקרה והתוצאה היא חיובית, לבקשת לקוח, ניתן לשלוח את תוצרי ה PCR לריצוף בשיטת sanger ולקבל על פי הריצוף זיהוי מהיר של זן ה Mycoplasma שזיהם את הדוגמאות.
וולידציה בשיטת ה nested PCR
מדובר בהתאמה של השיטה למוצר הספציפי שנדרשת לבדיקה. בשביל זה מכל אצווה הלקוח מתבקש לשלוח 32 מבחנות עם 1 מל של דוגמא נבדקת בכל אחת. כחלק מהוולידציה אנחנו מאלחים את דוגמאות הלקוח ב 4 זנים שונים של Mycoplasma בכמות נמוכה של 10 cfu ובמקביל מאלחים גם בחיידקים שמומלצים על ידי הפארמקופאות לבדיקה של ספציפיות בכמות גדולה. את כל הדוגמאות האלו יחד עם כל הביקורות המלוות אותן אנחנו מכניסים לתהליך של טסט. בשלב זה, על פי התוצאות ניתן לבצע התאמות לשיטת ההפקה כדי לקבל את התוצאות המהימנות ביותר לסוג הדוגמא הספציפי. וולידציה מלאה היא בדיקה של 3 אצוות כאשר כל אצווה נבדקת על ידי 2 אנאליסטים. רק כאשר כל 6 הטסטים האלו מתקבלים עם תוצאות העומדות בכל הספסיפיקציות הוולידציה עוברת.
Mycoplasma Testing באמצעות Real-Time PCR
בדיקה בשיטה חדשנית ומהירה אף יותר לנוכחות Mycoplasma. הכנת הדוגמאות צריכה להתבצע באופן דומה לבדיקת ה nested PCR וגם כאן כל דגימה נבדקת גם כמו שהיא וגם בנוכחות של ביקורת פנימית שמלווה את הדגימה לאורך כל התהליך. במקביל, כל הדוגמאות עוברות הפקת DNA עם חומרים המיוצרים במעבדות חי. תוצרי ה DNA נכנסים לריאקציה של Real-Time PCR עם פריימרים ופרוב ספציפיים ל Mycoplasma שתוכננו במעבדות חי.
ניתן לבצע בשיטה זו וולידציה למוצר.
רגישות: 10 cfu/ml.
קבלת תוצאות: באותו יום.
גם כאן במקרה של זיהוי Mycoplasma בדוגמא של לקוח ניתן לשלוח את תוצרי ה Real-Time PCR לריצוף בשיטת sanger ולקבל על פי הריצוף זיהוי מהיר של זן ה Mycoplasma שזיהם את הדוגמאות.
קיט לבדיקת Mycoplasma עצמי
במעבדות חי אנחנו משווקים קיט איתו ניתן לבצע בדיקת Mycoplasma עצמית במעבדה שלכם. מקט KI-5034I. במקרה הצורך ניתן גם להזמין שירות שאנחנו נבצע את הטסט הזה אצלינו אבל חשוב לזכור שזה לא שיטה שאנחנו עושים לה וולידציה למוצר אלא רק למחקר. הקיט מכיל מבחנות ריאקציה עם כל המרכיבים הנדרשים ל PCR בפנים כולל ביקורת פנימית ומבחנה של ביקורת חיובית. מה נדרש לעשות זה לבצע הפקת DNA בכל שיטה שתחפצו, באינסרט של הקיט יש פירוט איך לבצע הפקה בהרתחה ולהכניס 5ul מכל הפקה למבחנת PCR. במקביל להכניס למבחנות נוספות גם ביקורת חיובית שתעבור PCR במקביל לדוגמאות. את התוצרים יש להריץ בג'ל וזה מה שצפוי לראות: בכל בארית שעברה PCR תקין שלא היה בו עיכוב נראה ביקורת פנימית בגובה בערך 700 bp. בדוגמא בה יש זיהום של Mycoplasma נראה תמונה דומה שמה שרואים בביקורת החיובית, נראה גם את הבנדים של הביקורת הפנימית וגם בנדים נמוכים יותר, בגובה בערך 500 bp שמייצגים תוצאה חיובית.
שליחת דוגמאות
הכנת דוגמאות באותו יום של השליחה: ניתן לשמור ולשלוח בקירור 4ºc.
הכנת דוגמאות מראש: דוגמאות שמחכות לילה יש להקפיא מתחת ל -60ºc ולשלוח בקרח יבש.
אנחנו לרשותכם: אם אתם מעוניינים לשלוח דוגמאות ולא יודעים איך להכין אותן או איך לשלוח צרו איתנו קשר ונתאם איתכם הכל.
Mycoplasma Testing – יתרונות השירות שלנו
לפרטים: