בדיקות גנטיות, זיהוי פלילי, NGS וריאקציות PCR פשוטות – אוליגו נוקלאוטידים משמשים כנקודת מוצא ליישומים רבים בביולוגיה מולקולרית. המאמר שלפניכם מתאר את השימושים האפשריים בהם, חשיבות השימוש באוליגו ספיציפי ונקי ככל האפשר והשימוש ב-Primers ו-Probes.
מאת: דוד פיליפוביץ – מנהל מכירות ביולוגיה מולקולרית, מחלקת הצלחת לקוח
נתחיל בבסיס שלנו, נוקלאוטידים – קבוצה של תרכובות אורגניות אשר יחדיו מרכיבות את אבני הבניין של הדנ"א. הנוקלאוטידים מורכבים משלושה חלקים. החלק החשוב, אשר מבדיל בין הנוקלאוטידים השונים ומעניק להם את שמם, הוא הבסיס החנקני. החומר התורשתי בנוי מנוקלאוטידים עם חמישה בסיסים חנקניים אפשריים: אדנין, גואנין, תימין, אורציל וציטוזין. ה-DNA מורכב מנוקלאוטידים הקשורים זה לזה על ידי צמדים של ארבע מולקולות המכונות בסיסים המכילים ציטוזין (C) עם גואנין (G) ותימין (T) עם אדנין (A), צמדים אלו קשורים בקשרי מימן. בנוקלאוטידים המרכיבים את ה-RNA לא מופיע תימין, ובמקומו מופיע אורציל (U).
אוליגו נוקלאוטידים או בקיצור אוליגו, זה השם הכולל למולקולות העשויות גדילים קצרים של נוקלאוטידים, דנ"א או רנ"א סינתטי ומשמשים כנקודת מוצא ליישומים רבים בביולוגיה מולקולרית. בדיקות גנטיות, זיהוי פלילי, NGS וריאקציות PCR פשוטות, האוליגו משמשים אותנו בשגרת היום-יום במעבדה ומחוצה לה.
כיצד משתמשים באוליגו?
את האוליגו כל חוקר יכול להתאים אישית למטרותיו. בתהליך של סינטזה סינטטית, 4 חומצות הגרעין, A, T, C ו-G, מתווספות אחת אחת ליצירת שרשרת הולכת וגדלה של נוקלאוטידים. במהלך מחזורים אלה של הוספת נוקלאוטיד או בסיס אחד למשנהו, השרשרת גדלה בכיוון '3 עד 5'. בסוף תהליך הסינתזה האוליגו עובר תהליך הסרת מלחים ומתקבל אוליגו Desalted אשר מוכן להיכנס לעבודה.
עם זאת, במהלך הסינתזה נוצרות גם שרשראות קצרות יותר או רצפי כשל. כך שבכל פעם שמתווסף בסיס לשרשרת הוא עלול להיכשל בהיצמדותו ועשוי לסייע ביצירת שרשרת צד קטנה יותר. שרשראות צד קטנות או רצפי כשל יכולים להתחרות ברצף באורך מלא ולשבש לנו את התוצאות במהלך העבודה.
ולכן, כאשר אנו מבצעים יישומים מורכבים יותר כמו NGS או Mutagenesis הדורשים ספציפיות מירבית, אנו נדרשים לאוליגו ספציפי ונקי ככל האפשר. השיטה הפופלרית כיום לטיהור אוליגו היא HPLC , שיטה זו מאפשרת לנו להתגבר על רצפי כשל ולקבל תוצר טהור יותר, מומלץ לאוליגו באורך של יותר מ-40 בסיסים.
שימושי אוליגו – למה משמשים Primers?
כמו שכבר הספקנו להכיר, קיימים מגוון שימושים לאוליגו. הדוגמא הפופולרית לשימוש באוליגו הם הפריימרים (Primers), ובעברית תקינה: תחלים. התחלים הם מקטעים קצרים המשמשים לתחילת תהליך הההכפלה (אמפליפיקציה). התחל כשמו כן הוא, משמש כאתר קישור ותחילת הכפלה בריאקצית ה- PCR וניתן כיום להתאימו למגוון רחב של מטרות. ל-PCR שלושה שלבים מחזוריים, דנטורציה (הפרדת גדילים), אנילינג (איחוי) ואלונגציה (התארכות הגדילים). כמו כן חמישה מרכיבים נדרשים לביצוע הריאקציה:
- תבנית DNA דו גדילי, זוג פריימרים, נוקלאוטידים, האנזים DNA polymerase ובופר מתאים.
- שלבי התגובה הם דנטורציה ובמהלכו שני גדילי DNA נפרדים.
- אנילינג, בשלב זה מתאחים שני Primers על הגדילים המנוגדים.
- אלונגציה, בשלב זה נקשר ה DNA polymerase אל הפריימרים ומתודתחיל לסנתז DNA במורד הגדיל.
שיטת ה-PCR הולידה שיטות רבות כמו ה realtime PCR המאפשרת מעקב בזמן אמת אחר קצב הכפלת הדנ"א ומכאן ללמוד על קצב ביטוי הגן אותו הוא מקודד.
שיטה נוספת היא ה- RT-PCR. שיטה זו מאפשרת הפיכת RNA ל DNA על ידי הוספת האנזים reverse transcriptase שמקורו בוירוס ה-HIV והופך RNA ל-DNA ואז הגברתו. שיטה זו מאפשרת חקר ביטוי גנים ברקמות או תאים שונים. שיטה זו משמשת גם להוספת אתרי חיתוך אנזימטיים או מוטציות בקטעי DNA ולעוד יישומים רבים ומגוונים.
יישומים מורכבים דורשים אוליגו ספציפי ונקי ככל האפשר.
כיצד פועלים פרובים?
באופן פעולתם הפרובים דומים לפריימרים אך אינם מהווים אתר התחלה להכפלת הדנ"א אלא אתר קישור לאזור ספציפי בדוגמא הנחקרת. בדומה, הפורבים הם מולק' חד גדיל של דנ"א או רנ"א אשר מטרתם להיקשר לרצף מטרה משלים בדנ"א בתנאים מסוימים.
הפרובים יכולים להיות מסומנים פלורסנטית או רדיואקטיבית ובכך לאפשר לנו למדוד את תהליך ההיברידציה, לראות היכן נקשר ה-DNA. לדוגמא אנו מסמנים פרובים עם מולקולות שונות כדי לעקוב אחריהם ולחפש היכן מתבטאים mRNA מסוימים בתא או ברקמה.
אנחנו יכולים גם להשתמש בפרובים כדי לסרוק את הגנום ולגלות אם ישנם עותקים נוספים, מה שקורה לעתים קרובות בסוגי סרטן, או עותקים חסרים של חלקים מסוימים של הגנום, מה שקורה בתסמונות תורשתיות.
האוליגו יכולים להגיע עם מגוון רחב של מודיפיקציות:
Antisense oligonucleotides
כלי מצוין לעיכוב רמות ביטוי גנים, הגילוי שלהם הציג גישה חדשה לפיתוח תרופות , שכן תרופות אנטי-סנס נועדו לעכב את הייצור של חלבונים הגורמים למחלות.
כלי זה מציע פוטנציאל לפיתוח תרופות יותר סלקטיביות ופחות רעילות.
Small interfering RNA (siRNA)
siRNA מווסתים את הביטוי של גנים ספציפיים, הם מתפקדים על ידי שיבוש למולקולות mRNA וכתוצאה מכך פוגעים בתהליך התרגום. מולקולות siRNA נמצאו כבעלי תפקיד מהותי במנגנונים אנטי-ויראליים או בעיצוב מבנה הכרומטין של הגנום ובעקבות כך הפכו לכלי מחקרי חשוב.
לפרטים נוספים והזמנת אוליגו: oligo@hylabs.co.il