השימוש ב-NGS ככלי לניתוח מיקרוביום הפך לתקן הזהב בתחום ושינה אותו לחלוטין. במאמר זה תוכלו למצוא תיאור קצר של השיטות בהן אנו משתמשים במעבדת ריצוף הדור הבא שלנו (Next Generation Sequencing).
ד"ר חיים ווכטל, מנהל מעבדת ריצוף הדור הבא (NGS), hylabs
המיקרוביום (Microbiome) הוא קהילת האורגניזמים החיים בדגימה. למשל מיקרוביום המעיים הוא קהילת המיקרואורגניזמים במעי. קיימת קהילה שלמה של חיידקים החיים בתוכנו, ועוזרים לנו בחיי היומיום שלנו. בשיטת ריצוף הדור הבא (NGS) המכונה גם (Massive Parallel Sequencing) יש תגובה אחת, מבחנה אחת עם אלפי חלקי DNA שונים שמרוצפים ומספקים אלפי, ואפילו מיליוני תשובות. NGS חוללה מהפכה במחקר במדעי הביולוגיה, בזכות התפוקה הגבוהה ביותר, התאמתה להיקפים גדלים והולכים כמו גם המהירות שלה. מהפכה זו אפשרה לחוקרים לבצע מגוון רחב של יישומים ולפתח דרכים חדשות לחקר מערכות ביולוגיות כמו כפי שלא נחקרו מעולם.
השימוש בריצוף הדור הבא (NGS) ככלי לניתוח מיקרוביום (Microbiome Analysis) הפך לתקן הזהב בתחום. היכולת לרצף דגימות מורכבות, המכילות מיקרואורגניזמים רבים ושונים, ללא צורך בבידוד האורגניזמים השונים, שינתה את התחום כולו. כיום נהוג לרצף כשגרה דגימות שונות מהמיקרוביום בכל תחומי המחקר.
Microbiome Analysis – שתי גישות שונות
ישנן שתי גישות שונות ללימודי מיקרוביום באמצעות: Amplicon Sequencing או באמצעות Metagenomic Sequencing. מעבדת ה NGS שלנו מציעה שירותי 16s, 18s, and ITS Microbiome כמו גם ריצוף Metagenomic. הצוות שלנו יכול לעזור בפרויקט החל מהפקת DNA וכלה בהכנת ספריה, רצף וניתוח. דוגמאות אופייניות המשמשות במחקרי מיקרוביום כוללות (אך אינן מוגבלות) לדגימות צואה, מטושים מהפה או העור, דגימות מים וסביבה אחרות ומטושים פני שטח.
ד"ר חיים ווכטל, מנהל מעבדת ריצוף הדור הבא (NGS) במעבדות חי.
ישנם כמה הבדלים בין שתי הגישות, כולל אך לא מוגבל ל:
• פרוטוקול בניית ספרייה – מבוסס Amplicon או גנום שלם.
• כמות הנתונים הנדרשת – באופן כללי ניתוח מיקרוביום מבוסס Amplicon דורש פחות נתונים לכל דגימה, מכיוון שאתה משתמש בגן יחיד לזיהוי המיקרואורגניזמים השונים.
• ניתוח – בסיס הניתוח בשתי הגישות דומה, מחפש רצפים שיכולים לזהות את המיקרואורגניזמים במדגם. אמנם הגישה המבוססת על amplicon מצריכה מאגרי מידע קטנים יותר, למשל של רצפי 16s , אך גישת metagenomic עשויה להימשך זמן רב יותר, אך אמורה לאפשר קבלת רזולוציה טובה יותר בזיהוי.
אין ברירה נכונה או לא נכונה, וצוות ה- NGS שלנו ישמח לעזור בתכנון הניסויים הדרושים.
שלבים וטיפים מכריעים לפרויקט מיקרוביום מסוג amplicon (16s, 18s, ITS) מוצלח:
• מיצוי DNA
oהשלב החשוב ביותר בתהליך כולו. לא משנה מה חומר המוצא, אם שיטת החילוץ שנבחרה אינה עובדת טוב, לא יתקבלו תוצאות טובות.
o אנו משתמשים ב Magcore Plus II עם ערכת רקמות ה- DNA הגנומית. לפני הטיפול ב- Proteinase K, דגימות ממוקמות במבחנה עם בידים של Geneaid מסוג C ועוברים ל”Bead Beater”-. שלב הכאת החרוז הוא קריטי להפקת DNA חיידקית מוצלחת מדגימות צואה או אדמה, ואנחנו משתמשים בו כמעט לכל פרויקטי המיקרוביום שלנו, לא משנה איזה סוג של חומר התחלתי.
• הכנת ספריית Amplicon
o אנו משתמשים בפרוטוקול PCR דו-שלבי כדי ליצור ספריות amplicon עבור רצף Illumina. ב- PCR הראשון אנו מגבירים אזור של 16s, 18s or ITS הפריימרים בהם אנו משתמשים מותאמים מפרויקט Earth Microbiome כדי להפוך אותם לתואמים למתאמים מסחריים. ב- PCR השני מתווספים רצפי האינדקס והמתאם הנדרשים לרצף Illumina.
10-20o ננוגרם של DNA משמשים כתבנית לתגובת ה- PCR הראשונה.
oלאחר ה- PCR השני הדוגמאות מנוקות באמצעות חרוזי SPRI ואז נמדדים ריכוזים באמצעות בדיקת ה- DNA של Denovix HS. גודל הספריות מאומת על ידי ניתוח Tapestation, ואז הדוגמאות מוכנות להטענה ב- Illumina Miseq.
oריצוף
oלאחר שהדגימות עוברות את ה- QC שלנו, הן נטענות על Illumina Miseq. לעבודה במיקרוביום אנו בדרך כלל מכוונים ל 25,000 קריאות לדגימה, לפני הניתוח, אך תמיד יש אפשרויות לייצר נתונים נוספים לדגימה.
o המפתח לריצת רצף מוצלחת כולל הוספת הכמות הנכונה של Phi X כדי להגדיל את המגוון והורדת הכמות הטוחנת של הדגימה הטעונה כדי להקטין את הצפיפות בתא הזרימה.
o טבלאות OTU יחד עם הנתונים הגולמיים (קבצי FASTQ) נשלחים לכל לקוח.
לא רק מעבדת שירות
במהלך חמש השנים האחרונות, זכתה מעבדת ה-NGS של hylabs להשתתף בשני פרויקטים מחקריים שונים הבוחנים את כוחות הניבוי של מיקרוביום המעיים.
צפו עכשיו –
סרטון קצר עם תשובות לשאלות נפוצות בנושא NGS
האם מיקרוביום המעיים שלך יכול לחזות את התוצאה של ניתוח בריאטרי?
לפני חמש שנים הוענק להילאבס בשיתוף Genewiz מענק מטעם ישראל-ארה"ב. קרן מחקר ופיתוח תעשייתית דו לאומית (BIRD Foundation), לחקר הקשר בין ניתוח בריאטרי למיקרוביום.
במאבק העולמי נגד השמנת יתר וסוכרת, ניתוח בריאטרי הפך לאחד הכלים הנבחרים על ידי רופאים, עם ~ 800,000 מקרים בשנה ברחבי העולם. אמנם הניתוח הפך כמעט לשגרתי, אך התוצאה משתנה מאוד. ליכולת לחזות את שינוי מדד מסת הגוף (BMI) לטווח הארוך בעקבות הניתוח יש השלכות חשובות על אנשים ועל מערכת הבריאות בכלל. לאור הקשר ההדוק בין הרגלי אכילה, צריכת סוכר, BMI ומיקרוביום המעיים, בדקנו אם פרופיל המיקרוביום של המעיים לפני הניתוח קשור לתוצאות שונות. מצאנו, על ידי השלכת/הקרנת הרכב המיקרוביום במעיים למרכיבים עיקריים, כי שלוש הקבוצות השונות שנחקרו: רזה, בעלי השמנת יתר ובעלי השמנת יתר שעברו ניתוח בריאטרי הנן בעלות פרופילי מיקרוביום שונים.
ההשלכה הראתה כי קיימים פרופילים נפרדים לכל שלוש הקבוצות, כאשר קבוצת השמנים שעברו ניתוח שונה יותר מאשר קבוצת הרזים וקבוצת השמנת יתר. אותה השלכה אפשרה לחזות אובדן BMI בעקבות ניתוח, תוך שימוש בפרופיל המיקרוביום לפני הניתוח.
פיתוח כלים לתעשיית המזון באמצעות ניתוח מיקרוביום
כחלק מקונסורציום העוסק באיסוף ביג-דאטה בתעשיית המזון, Hylabs פיתחה שיטה לדיגום ומדידת המיקרוביום (Microbiome Analysis) בפס הייצור של מפעלים המכינים אוכל. דגימת מיקומים שונים בקו הייצור, ביצוע NGS לזיהוי המיקרוביום ושימוש במודל מתמטי, אפשרה לנו לזהות סמנים ביולוגיים חיידקיים המאפשרים לתת התראות על הסכנה להתפרצויות זיהומים זמן רב לפני שההתפרצות התרחשה, וכך לאפשר ליצרנית המזון להבטיח את בטיחות המזון ובטיחות הציבור.
כעת אנו מפתחים שיטה מהירה שתאפשר לדגום את הסמנים הביולוגיים על ידי צוות בקרת האיכות של יצרניות המזון, כחלק מתקדם בפעילות מונעת בהתאם לתקן האיכות והבטיחות החדש למזון של ה- FDA.
הפיתוח והמודלים בשני הפרויקטים בוצעו בשיתוף פעולה עם פרופסור עומרי קורן ופרופסור יורם לוזון מאוניברסיטת בר אילן.
לפרטים נוספים הנכם מוזמנים ליצור קשר עם ד"ר חיים ווכטל chaim@hylabs.co.il
רוצים ללמוד עוד על שיטת ריצוף הדור הבא (NGS)? מוזמנים לצפות בוובינר שעסק בנושא
